线粒体是一种半自主细胞器，拥有独立的遗传物质，即线粒体DNA (mtDNA)。mtDNA是一种多拷贝、环状、双链DNA分子，编码了氧化磷酸化（OXPHOS）所必需的13种蛋白质。此外，核基因组编码的1,000多种蛋白质有助于线粒体的生物转化和功能；其中包括OXPHOS系统及维持线粒体正常功能所需的其他蛋白质。因此，维持线粒体稳态是由核基因组和mtDNA双重遗传控制的。核基因组和线粒体基因组中的致病变异都可能导致线粒体疾病。

线粒体疾病是由功能失调的线粒体引起的一类遗传性疾病，主要是由于呼吸链酶复合物的缺陷，影响ATP的产生。线粒体疾病单独来看是罕见的，但线粒体病作为一系列疾病其实并不罕见。它是最常见的遗传性神经疾病组之一，在成年人中的患病率为1/4300 (22.9/100,000)。线粒体疾病在临床和基因上都是异质性的，可出现在任何年龄，包括从严重的儿童早期发病综合症到较轻的晚发病症，甚至在具有相同潜在突变的患者中也是如此。这些疾病表现出惊人的和目前很难被解释的组织选择性，疾病目前无法被治愈并且会造成严重的健康不良和过早死亡。大多数线粒体疾病患者表现为多器官受累，特别是脑和心脏等对能量需求较高的器官。单一器官很少受影响，最突出的例子是Leber遗传性视神经病变(LHON)中的孤立性视神经萎缩。此外，mtDNA突变也存在于健康人类中，并与常见的多因素疾病有关，这些疾病的患病率在老龄化人口中不断增加，包括神经退行性疾病，如帕金森病、代谢疾病、心力衰竭和癌症。因此，寻求新的有效的方法以最终治疗或预防这一系列疾病，具有重要的临床价值。

尽管目前的基因组工程革命是通过CRISPR-Cas技术实现的，但由于真核细胞内缺乏将sgRNA转运至线粒体的机制，因此，无法利用CRISPR-Cas基因编辑工具实现线粒体基因组的精准编辑，阻碍了mtDNA疾病体内模型的建立和治疗方法的开发。迄今为止，只有5个mtDNA疾病的小鼠模型被表征，这些动物模型都为线粒体功能障碍或辅助治疗临床前试验提供了重要的新信息。

虽然线粒体替代疗法已经发展到通过在卵母细胞或胚胎中进行原核转移或染色体纺锤体转移来防止mtDNA突变的遗传，但这种方法无法治愈现有的或新出现的病例。目前临床前mtDNA基因操纵方面已取得一些进展，但该领域需要在人类细胞和动物模型中对mtDNA进行遗传修饰继续探索，以便更好地了解mtDNA相关疾病的发病机制，并为未来的临床应用铺平道路。

以哺乳动物系统为重点，在这里我们首先简要概述mtDNA的稳态维持以及异质性和同质性的概念，然后讨论线粒体基因组靶向编辑的研究。我们描述了建立mtDNA 疾病动物模型、可编程的线粒体靶向核酸酶的发展等近三十年来的研究，这些核酸酶能够在体外和体内促进 mtDNA 异质性的改变以及 mtDNA 缺失的产生。最后,新开发的 mtDNA 碱基编辑器能够实现特定位点的点突变。本文我们回顾了最近的研究进展及其在 mtDNA 相关疾病疗法的应用前景。

人体细胞含有数百至数千个mtDNA 分子。与核基因组相比，mtDNA 复制与细胞周期无关，并且即使在有丝分裂后的细胞中，mtDNA也能通过相应的机制进行连续复制。mtDNA 拷贝数受到严格的调控，很大程度上取决于细胞类型和组织能量需求。例如，白细胞中含有约100个mtDNA分子，而中枢神经元则含有约 10,000 个mtDNA分子。培养细胞中 mtDNA 的消耗通常是可逆的，并且在几天内就能恢复到正常水平，这进一步表明了mtDNA 水平是受到严格调控的。

与核 DNA 一样，mtDNA 也容易受到细胞内（例如：氧化损伤或复制错误）或外源（例如：辐射）因素造成的损伤。基于mtDNA的多拷贝特性和哺乳动物线粒体紫外线诱导的嘧啶二聚体的观察发现mtDNA损伤导致的突变通常由核苷酸切除修复 (NER) 来处理，因此线粒体并没有DNA修复机制。然而相关研究表明，线粒体中存在碱基切除修复 (BER) 和单链断裂 (SSB) 修复途径。线粒体 BER 可参与修复氧化性DNA损伤和由烷基化和脱氨作用导致的损伤。尽管如此，双链断裂 (DSB) 的有效线粒体修复机制的存在仍受到疑问，包括同源重组 (HDR) 和非同源末端连接 (NHEJ)。在核基因组中，位点特异性 DNA 断裂会刺激发生HDR；与核基因组不同，mtDNA的DSB 主要导致 mtDNA 的快速降解，而不是线粒体DNA修复机制。与这一发现一致的是，在对携带非致病性突变的 50 代小鼠的分析中，未发现哺乳动物 mtDNA 的重组，表明 mtDNA 的分子内是否发生HDR可忽略不计。有极少DSB 被重新连接并与重排的 mtDNA 分子的形成相关，这表明线粒体中残留的低水平 NHEJ 活性。有研究报道的老龄化成人及小鼠的深度测序数据认为线粒体中存在有效修复机制，但其表明氧化损伤并不是mtDNA 突变主要原因，主要原因是复制缺陷。尽管 mtDNA的复制酶 Pol γ 的保真度是生命领域的所有已知聚合酶中最好的，但mtDNA的连续复制性质增加了其引入复制缺陷的几率。

据统计约 80% 的成人和 20-25% 的儿童的线粒体疾病是由 mtDNA 突变引起的。致病性的mtDNA突变可以直接或间接地影响参与OXPHOS的蛋白质。mtDNA的蛋白质编码基因的突变可直接影响其功能，线粒体 tRNA或 rRNA编码基因的突变则会扰乱这些蛋白质的合成。此外，mtDNA 的重排，例如大范围的 mtDNA 缺失，通常会破坏多个蛋白质编码基因以及tRNA。

许多线粒体疾病的复杂性是由mtDNA的多拷贝特性所导致。通常，有致病性突变的mtDNA分子与正常的 mtDNA 分子共存，这种情况称为异质性。在发育过程中，遗传瓶颈的存在以及突变mtDNA 在各组织中的不均匀分布都可能导致临床上显著的异质性波动。在整个生命周期中，某些 mtDNA 基因型可以在有丝分裂后组织中积累—即克隆扩增，导致突变的mtDNA超过野生型。而mtDNA 突变的致病性由突变负荷决定，也就是说，由生化 OXPHOS 缺陷引起的临床表现通常需要异质性突变体 mtDNA 处在某个致病性阈值以上（通常为60-90%）。并且异质性水平与发展为严重疾病的风险相关，例如，当异质性水平<70%时，具有m.8993T>G 突变的个体通常为无症状。而异质性水平为70-90% 的个体临床表现为 NARP表型（神经源性肌肉无力、共济失调和视网膜色素变性），异质性水平 >90% 临床表现为 Leigh 综合征。重要的是，具有相似异质性水平的相同 mtDNA 突变也可能会导致不同的临床结果。例如，最常见的 mtDNA 突变之一m.3243A>G相似的异质性却与许多综合征相关。

细胞只携带突变的 mtDNA，而没有野生型 mtDNA，这种情况称为同质性。即使在这种情况下，外显率和临床表现也可能会有不同，提示应该存在着其他因素的影响。例如，与 LHON 相关的 mtDNA 突变通常是同质的，并不是每个人都表现出临床异常。事实上，目前已经观察到男性患 LHON 的风险更高，可能与生活方式的因素有关。据报道，线粒体的生物发生或 mtDNA 拷贝数的自然变化会影响 LHON 的外显率。这一发现表明，由 mtDNA 突变驱动的临床结果的发生会受到其他遗传、环境和表观遗传因素的影响。

突变的mtDNA也可能存在于健康人体内。多年来，异质性被认为是一种罕见的事件，但随着mtDNA 深度测序的出现，低水平的异质性 (0.5-1%) 似乎是一个普遍的发现。线粒体遗传学的复杂性使得线粒体基因组的治疗操作充满挑战，任何旨在靶向 mtDNA 的方法都需要考虑 mtDNA 的多拷贝特性、异质性阈值效应和突变的克隆扩增等方面。因此，需要稳定修饰足够数量的 mtDNA 分子才能发挥更有效的治疗效果。

生物有机体的遗传转化过程需要摄取外源DNA，以取代内源遗传物质，使其在宿主中共存或重组到受体基因组中。迄今为止，活细胞中线粒体的常规遗传转化仅在面包酵母和单细胞绿藻中实现过，DNA通过“基因枪”轰击输送到细胞器中，但在这些实验中基因枪方法的效率较低。

很多研究已经尝试将 DNA 递送到活细胞中的哺乳动物线粒体中，目前已经尝试了基于“嗜线粒体”囊泡的基因枪和其他方法将DNA传递至哺乳动物活细胞的线粒体中，例如基于去喹啉的阳离子囊泡 (DQAsomes) 或基于非阳离子脂质体的载体（DF-MITO-Porter）。目前已有研究报道将DNA输送至培养细胞的线粒体中取得了一些进展，但这些方法都没有实现常规、稳定的mtDNA转染并传输到子细胞，这是产生新的线粒体遗传变异的先决条件。基于改良的腺相关病毒 (AAV) 载体，实现了在体内将mtDNA 递送至线粒体，该载体包含与外衣壳蛋白 (MTS-AAV) 融合的线粒体靶向序列 (MTS)。有研究报道可将包含的 mtDNA 的MTS-AAV成功递送、重组和表达到线粒体基质中，但目前尚不清楚 MTS-AAV 如何进入细胞器以及包壳 DNA 如何在病毒进入时释放的。

哺乳动物线粒体的遗传转化较难实现可能有几个原因。首先是线粒体是双膜结构的细胞器，其最内层是不可渗透的，特别是对于大的亲水性阴离子，通过微粒轰击等处理可能会导致外膜破裂，进而从线粒体内膜空间释放细胞色素C，通过线粒体依赖性细胞凋亡引发转染细胞死亡。并且目前的实验证据不支持哺乳动物mtDNA 的有效重组活性的存在。因此，与酵母或绿藻不同，线粒体递送的 mtDNA 不能轻易整合到宿主基因组中。最后，即使实现了完整mtDNA的传递或将所需结构重组到线粒体中，若从超过1,000 个分子的混合体中选择所需的突变体 mtDNA 以达到实验或治疗有效水平的编辑仍然存在着较大难度。

虽然目前无法将 DNA 转染到线粒体中，但在培养的动物细胞之间完整的线粒体转移早已建立起来。此过程可以将替代的mtDNA基因型引入宿主细胞。一种行之有效的产生传输线粒体细胞质杂交细胞（胞质杂交体）的方法是包括将mtDNA缺失(ρ0)的受体细胞与含有目标的 mtDNA 基因型的去核供体细胞融合。目前相同的概念已被用于将线粒体引入生殖细胞以产生“线粒体转移”小鼠。这是通过将含有所需 mtDNA 的体细胞的细胞质融合到胚胎中或通过创建杂交胚胎干细胞来实现的，这些细胞随后通过囊胚注射方式打入早期胚胎以获得嵌合体动物。用供体细胞核重建去核细胞质的概念引领了线粒体替代疗法的发展，能有效防止突变的线粒体 DNA的代际传播。细胞间完整线粒体转移的相关方法虽已在分子和个体水平上被证明对于研究mtDNA突变极为重要，但它们的应用目前仅限于已存在的线粒体变异。

上述所有方法都只能依赖于线粒体与胞质一起转移，而不是单独转移。通过这种方式分离的线粒体可以成功地显微注射到培养的活细胞中，然而效率非常低，需要严格地筛选才能维持被传递的mtDNA，而且目前利用分离的线粒体通过显微注射入生殖细胞中的方法还尚未获得小鼠模型。值得注意的是，培养的细胞、器官和组织已被报道会自发地吸收分离的线粒体，这一过程通常被称为“线粒体移植”。尽管摄取和保留递送的线粒体的机制尚不明确，而且据报道获得稳定转化体的效率也普遍较低（每105-106的细胞只有几个克隆，通常使用数十至数百微克来分离线粒体），但该方法已进行了针对患有单一的较大范围的mtDNA缺失疾病(SLSMD)的患者的临床试验。此外，光热纳米刀片（生物光子激光辅助装置）和 MitoPunch可以将分离的线粒体输送到细胞中；这些方法的特点是具有更高的吞吐量，并可根据已存在的mtDNA突变体生成有用的mtDNA模型。目前已有很多研究尝试利用新方法来转染分离的线粒体（通过劫持蛋白质输入机制，将分离的细胞器与细菌结合，电穿孔或利用分离的线粒体的天然能力来吸收 DNA），但这些实验都未开发出能在哺乳动物细胞中针对线粒体进行遗传修饰的常规的可重复的方法。

鉴于mtDNA位点特异性修饰存在的挑战，目前已经开发了几种随机诱变方法。化学和辐射诱导的诱变后，mtDNA拷贝数的严重减少，再加上大规模的负选择复制，会导致产生几种新的 mtDNA 突变哺乳动物细胞系。这些细胞既可用于研究基本的线粒体过程，也可在某一例研究中作为突变线粒体 DNA 的来源，能够在小鼠模型生成过程中产生用作卵母细胞注射的胚胎干细胞。

mtDNA 中的随机突变也已通过遗传改变线粒体复制机制的组件引入。其中一项突破性进展是开发mtDNA突变模型小鼠，通过敲入一个突变来破坏线粒体 DNA 复制酶 Pol γ（Polg1，D257A）的催化亚基的校对活性。由校对缺陷的 Pol γ 引入的 mtDNA 突变的雌性种系传递与多步骤的饲养繁育工作相结合，限制了其传递突变的数量，允许通过筛选结肠隐窝中的 OXPHOS 功能来选择具有异质点突变的小鼠品系。此外，使用此方法生成的克隆小鼠包含异质性 mt-tRNAAla 突变 m.5024 C>T（以及相关功能上的良性的 MT-Nd6 变体）。当m.5024 C>T异质性水平>60%时，突变小鼠在成年期出现肥厚性心肌病和相关的心脏缺陷，是由于mt-tRNAAla 稳态水平的大幅下降和线粒体翻译的损伤。而且小鼠的m.5024 C>T突变类似于人类致病性 m.5650 G>A突变，是线粒体肌病的重要病因。目前该模型与线粒体 tRNA 突变引起的许多 mtDNA 疾病都具有临床相关性，已被用于一系列针对 mtDNA 的临床前干预的研究。

基于校正缺陷型的Pol γ对mtDNA 进行有限诱变的方法，然后分离异质性mtDNA克隆，也可被用于在体外生成超过150 种小鼠细胞系的集合，这些细胞系可用于产生线粒体转移小鼠。果蝇 PolG1（D263A，也被称为 tamas）的校正缺陷等位基因也被用于产生杂合突变的果蝇。与小鼠模型不同的是，mtDNA 突变的果蝇没有表现出任何主要的表型并且具有正常的寿命。然而，基于线粒体靶向可诱导的胞苷脱氨酶 APOBEC1 (mito-APOBEC1) 的另一种 mtDNA 突变果蝇模型中，C-to-T (G-to-A) mtDNA 诱变增加，限制了其线粒体功能、机体活力及寿命。PolG1 D263A 和 mito-APOBEC1 模型中的突变谱比较表明，mtDNA 突变谱对于扰乱机体适应性来说至关重要。mito-APOBEC1的方法可以提供优于现有的mtDNA 诱变系统的优势，还有待将其进一步扩展至出哺乳动物模型的开发。

最初，线粒体靶向限制性核酸内切酶 (mitoREs) 用于在特定的mtDNA 序列上生成 DSB，从而达到迅速减少靶向的mtDNA的目的。相关研究发现通过 Southern 印迹、深度测序或PCR等方法，mitoREs 可以找到 靶标的mtDNA 并引入 DSB。若将这些核酸酶加上MTS，则可以通过天然的输入机制（TOM-TIM 复合物）输送到线粒体。通过使用 mitoPstI 核酸内切酶，首次实现了改变含有大鼠和小鼠 mtDNA 混合物的杂交细胞系的异质性。此外，有研究报道mitoApaLI 可以区分携带两个非致病性 NZB-BALB/c mtDNA 单倍型（BALB/c-位于m.5461的单个ApaLI位点；NZB-无 ApaLI 位点）的线粒体小鼠中的线粒体 DNA；在培养的肝细胞和小鼠单细胞胚胎中，使用mitoApaLI可以将异质性转移到NZB mtDNA上，选择性地阻止了BALB/c mtDNA 种系传递，并且可以使用 AAV 载体在体内将其递送到各种组织中。此外，与 NARP 和母系遗传 Leigh 综合征 (MILS) 相关的 m.8993 T>G 突变是第一个也是唯一一个能够以 mitoREs SmaI和XmaI为靶点的人类 mtDNA 变体，可以通过野生型 mtDNA 重新繁殖来拯救一些由胞质杂交细胞突变引起的线粒体疾病表型。

核基因组的基因编辑研究进展促进了DNA 位点特异性锌指核酸酶 (ZFN)和转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)的发展，它们主要是由模块化的可编程的序列特异性 DNA 结合结构域来组成，并且与IIS型酶的 FokI 的序列非依赖性核酸内切酶结构域相连。要创建 DNA DSBs，两个 ZFN 或 TALEN 单体在空间上必须非常接近，使得两个FokI单体能够发生二聚体化进而发挥核酸切割作用。ZFN和TALEN最初被用于核基因组DNA编辑，目前也已有研究报道利用添加了MTS的mtZFNs和mitoTALENs来靶向线粒体。mtZFNs 和 mitoTALENs 的二聚体结构可用于靶向mtDNA的突变位点和缺失位点。mtZFNs 和 mitoTALENs 目前都已被用作多种携带致病性 mtDNA 点突变或缺失的模型中的异质性转移，包括胞质杂交细胞、诱导多能干细胞 (iPSCs) 和小鼠卵母细胞。在胞质杂交模型中，利用mtZFNs 或 mitoTALENs 瞬时转染的细胞表现出向野生型 mtDNA显著的异质性转移，随后mtDNA 拷贝数增加。此外，突变水平的变化随时间的推移保持稳定状态，线粒体功能的也得到一定改善。

mtZFNs 和 mitoTALENs 在体外成功的应用凸显了其未来可能成为新的治疗平台的潜力。临床上应用 mtZFN 的关键是体内递送和功效证明。两种核酸酶都已在 mt-tRNAAla 基因突变的异质性 m.5024 C>T 小鼠模型中进行了检测，将一对 mtZFN 或 mitoTALEN 单体包裹到肌肉嗜性 AAV9 衣壳中，并通过全身（mtZFNs或mitoTALENs）或局部（mitoTALENs，肌肉注射到胫骨前肌）的方式给小鼠给药。经过mtZFN 和 mitoTALEN 处理的动物表现为被靶向组织中 m.5024 C>T 突变体mtDNA 的减少，并且呈现剂量依赖性的效果。最后，在体内观察到的含有 m.5024 C>T 分子的mtDNA 的异质性转移会伴随疾病表型而改善，可以通过mt-tRNAAla水平的稳定评估，对几种线粒体代谢物的恢复情况进行评估。在优化后的 AAV 剂量作用下，并未观察到可检测到的线粒体脱靶活性（mtDNA 重排或拷贝数减少），且未发现核基因组中存在脱靶效应。除了传统的二聚体的 mtZFNs 和 mitoTALENs，它们的单体衍生物已被成功用于改变活细胞中的 mtDNA 异质性，包括单链 mtZFN (sc-mtZFN)，即锌指蛋白 (ZFP) 与单个多肽中的两个 FokI 催化结构域；以及单链mitoTev-TALE，即TALE 结构域与I-TevI 而非FokI核酸酶进行连接。与二聚体 mtZFN 或 mitoTALEN 相比，sc-mtZFN和mitoTev-TALE 都能识别更短的mtDNA靶标，鉴于哺乳动物线粒体基因组的尺寸较小，这种特异性应该足以应对mtDNA点突变的特异性识别。

基于可编程核酸酶的异质性转移方法无法在mtDNA 中引入新的特定的核苷酸突变，这严重限制了我们建立相关线粒体疾病研究模型，同时它们也不能用于靶向同质性 mtDNA 突变。受 CRISPR-Cas 碱基编辑策略的启发，最近出现了一种重要的 mtDNA 诱变新工具。Mok 等人利用细菌胞苷脱氨酶在培养的人类细胞的线粒体DNA 中证明可发生有效的C-to-T的碱基转换。

最初使用胞苷脱氨酶进行碱基编辑是为了修饰核基因组，胞嘧啶C脱氨基产生尿嘧啶U，聚合酶将其视为胸腺嘧啶T，导致在DNA第一轮复制期间将腺嘌呤A掺入相反的链中。在第二轮复制中，聚合酶使用腺嘌呤A作为模板掺入胸腺嘧啶T，从而取代原来的胞嘧啶C。核基因的C-to-T（或G-to-A）转换已通过作用于单链 DNA的胞苷脱氨酶实现（例如 APOBEC1），靶DNA序列能够通过RNA引导催化失活的Cas9 (dCas9)进行特异性识别。在 dCas9-引导 RNA-DNA 复合物形成后，可进行一段 DNA 的置换，形成 ssDNA的“气泡”。然而，RNA 引导的 CRISPR-Cas 系统尚未能被用在线粒体中。DddAtox 是一种细菌胞苷脱氨酶（源于洋葱伯克霍尔德菌），它可作用于双链 DNA (dsDNA)，从而能够对 mtDNA 进行无 CRISPR-Cas9 碱基编辑。由于全长 DddAtox 具有一定毒性，该蛋白质被分成两个无活性部分（DddAtox-N 和 DddAtox-C），并利用与可编程的二聚体核酸酶以尾对尾方向作用，DddAtox会在靶向的DNA位点附近发生重组，类似于FokI，将两个无活性的一半DddAtox分别融合到一对靶向mtDNA的TALE 阵列的 C末端。通过在 C 末端添加尿嘧啶糖基化酶抑制剂 (UGI)，进一步提高了其编辑效率。因为UGI可抑制线粒体 UNG1，能够阻碍碱基切除修复期间尿嘧啶的切除。最终，基于DddA设计的胞嘧啶碱基编辑器，即DdCBE，在体外培养细胞系中成功对五个人类 mtDNA 基因位点进行了碱基编辑，编辑效率为5% -50%，并且具有极低的mtDNA和核DNA脱靶效应。DdCBE 技术有望在 mtDNA基因操纵方面开辟新的可能性，未来可对动物细胞中的线粒体基因组进行逆向基因工程，并最终纠正 mtDNA 中的同质和异质性致病点突变。

线粒体疾病的治疗手段非常有限，目前还没有治愈线粒体疾病的疗法，设计核酸酶和碱基编辑器的开发为治疗mtDNA疾病带来希望。此外，最近在临床试验中进行了一种基于重组 AAV递送的，能够在LHON中将突变mtDNA 编码的MT-Nd4 基因重新正常表达的方法；并且其临床III 期试验报告显示，LHON患者的眼功能有所改善。这一里程碑的结果为线粒体疾病的治疗提供了机会，可在未来作为直接改变 mtDNA 的新兴的基因工具应用于临床。目前仍需要收集更多关键的临床前实验数据，并且不可低估临床试验设计和执行前安全方面的重大挑战。

mtDNA基因工程平台与不断改进的组织特异性 AAV载体库的结合可以为 mtDNA 疾病提供潜在的治疗方法。目前大多数用于治疗人类疾病的核基因编辑临床试验都只涉及体外基因编辑，即将体外基因编辑的细胞移植回患者体内。在涉及体内递送的线粒体 DNA 编辑临床试验中，主要是使用 AAV 载体包裹的mtDNA基因编辑工具靶向患者的单个器官（例如，眼睛等）。由于线粒体疾病的异质性、多器官特性，以及主要为神经肌肉表现，需要在治疗过程中进行具有广泛组织分布的全身递送，很少有患者能够从体外 mtDNA 修复中得到有效治疗。因此，开发和实施安全、有效且具有成本低的 AAV 递送方法，使 mtDNA 编辑工具可输送到所需类型的细胞中将是一项重大挑战。目前，几项正在进行临床试验已报告，能够将基因编辑工具成功递送至全身肌肉组织，并可广泛地递送至中枢神经系统，且已取得可喜的治疗结果。AAV 载体可以作为治疗性的异质性或同质性修饰方法的备选，因为 AAV 传递的 DNA基因编辑工具在输送到细胞中能够持续存在很长时间，可以确保长时间的对突变mtDNA的持续作用。尽管目前已在小鼠的临床前实验中成功实现了异质性转移，但系统共注射的 AAV 颗粒在单独的病毒体中递送 mtZFN 或 mitoTALEN 单体可能需要依赖于较高的病毒滴度。因此，寻找携带 mtDNA 基因编辑工具并且能够降低AAV滴度至合适范围的方法将是未来临床应用的关键。

在将任何基因组编辑工具转化为临床时，脱靶效应都是一个重大问题。在应用核酸酶的方法（mtZFN、mitoTALEN）时，另一个问题是当突变体 mtDNA 被消除且在内源性野生型 mtDNA 重新填充之前，总mtDNA 拷贝数的短暂减少。此外，由于基因编辑工具特异性不佳，线粒体脱靶可能导致野生型 mtDNA 的消除。虽然急性的mtDNA 降解是值得关注的问题，但低速率降解应该不会构成较大阻碍，因为消除的分子可以被新复制的 mtDNA迅速取代。目前，在人类培养细胞中使用DdCBE的实验结果只显示出极低水平的 mtDNA 脱靶效应，但最近一项在斑马鱼胚胎中使用 DdCBE和两项线粒体基因组的研究表明，DdCBE 可能会引起大量脱靶效应。目前研究表明在DdCBE中添加UGI可以减少编辑位点的碱基切除修复，但将其应用在临床试验之前，需要着重考虑抑制这种线粒体 DNA 修复途径会带来的长期影响。由于mtDNA 基因编辑工具携带线粒体定位信号，因此关于核DNA的脱靶效应目前无需担忧。此外，目前尚未观察到 DdCBE 的核脱靶效应。尽管如此，还应对核DNA和mtDNA中是否出现脱靶效应进行进一步彻底的分析，以保证 mtDNA 基因编辑的安全性，顺利地从实验室过渡到临床试验。

基于线粒体疾病的了解、诊断的最新进展，提高了我们对这些疾病的许多临床表现和自然病程的认识。目前可进入线粒体编辑的核酸酶已在体外实验得到一些验证，并已被应用于体内线粒体基因组修饰。受 CRISPR-Cas9 碱基编辑器策略的启发，DdCBE目前已成为 mtDNA 基因修饰的重要新工具，这些工具现已用于基础和临床前研究（例如，在体内模拟致病性 mtDNA 突变），并且它们能够与不断改进的组织递送方法相结合，为安全有效地治疗mtDNA相关线粒体疾病提供了可能。

除了专注于现有工具的进一步开发和临床转化之外，继续探索 mtDNA工程的新技术也至关重要。尤其是开发其他类型的 mtDNA 编辑器，允许 A-to-G (T-to-C) 诱变并能够在体内引入 mtDNA 缺失。许多 mtDNA编辑方法将受益于“关闭开关”的应用，以此来最大限度地减少由于长时间表达而导致的潜在脱靶效应。因难以将guide RNA 引入线粒体，利用 CRISPR-Cas9 技术编辑哺乳动物 mtDNA 尚未实现。因此，开发将核酸转运到线粒体中的可行的方法能够将CRISPR-Cas9系统应用于mtDNA编辑，促进更加灵活的mtDNA诱变和mtDNA新序列整合，这些新的探索都有望推动线粒体基因组编辑领域开发出更广泛的研究工具，促进其人类治疗应用方向的发展。

参考文献：

Silva-Pinheiro, P., & Minczuk, M. (2022). The potential of mitochondrial genome engineering. Nature reviews. Genetics, 23(4), 199–214.