原发性线粒体疾病是一组以氧化磷酸化受损为特征的神经代谢紊乱疾病。对于该疾病的诊断具有挑战性；已知有350多个核基因和线粒体DNA（mtDNA）编码基因会导致线粒体疾病，产生所有可能的遗传模式，并且由于线粒体基因组多拷贝的异质性而进一步复杂化。以高通量测序技术为主的技术的进步推动了线粒体疾病诊断实践的转变，即从“优先活检”转向血液和/或尿液的全基因组DNA分析。这就需要为参与线粒体基因检测的实验室提供一个参考框架，以确保其能够提供高质量的服务。在英国，由国民保健服务（NHS）高度专业化服务的临床科学家工作组起草了共识指南，并经过全国实验室的讨论。这些指南总结了当前推荐的针对可疑线粒体疾病患者的mtDNA和核编码基因分析的技术和方法。其中包括遗传检测策略用于诊断、家族检测及产前诊断等生殖选择方面的内容。本指南重点包括为最常见的转诊原因提出最低水平mtDNA检测建议，以及适当转诊的指导意见和在分析核线粒体基因时最低适宜基因含量的信息。最后，我们还讨论了变异解释和结果报告的建议，特别侧重于解释和报告线粒体DNA变异所面临的挑战。

本指南重点包括为最常见的转诊原因提出最低水平mtDNA检测建议，以及适当转诊的指导意见和在分析核线粒体基因时最低适宜基因含量的信息。最后，本指南对mtDNA变异解释和报告结果的建议进行了讨论，着重关注解释和报告线粒体DNA变异所面临的挑战。

原发性线粒体疾病是以氧化磷酸化受损为特征的多样化的神经代谢紊乱。线粒体疾病在临床上表现为异质性，影响单个或多个器官系统，可能出现在任何年龄，并与显著的发病率和死亡率相关。据估计，成人中线粒体疾病的患病率约为每 100,000 人中 12.5 例，儿童中的患病率约为每 100,000 人中 4.7 例。然而，在普通人群中，致病性mtDNA变异的频率估计要更高，大约有每250名健康个体中有1人携带低水平的致病性mtDNA变异。

线粒体是存在于所有有核人类细胞中的双膜细胞器，其主要功能是通过氧化磷酸化（OXPHOS）生成三磷酸腺苷（ATP），但他们在包括信号传导途径和细胞凋亡在内的其他细胞过程中也至关重要。细胞内存在多个线粒体，通常在需要能量的细胞中数量较多。人类线粒体DNA （Human mitochondrial DNA, mtDNA）是一个环状基因组，由16,569对碱基对组成，包含一个调控mtDNA复制和转录的非编码D环区、13个编码OXPHOS亚基的蛋白质编码基因以及mtDNA 编码蛋白质转录和翻译所需的 22 个 tRNA 基因和 2 个 rRNA 基因。OXPHOS 过程以及线粒体基因组的维持、复制和转录所需的大多数线粒体蛋白都是由核基因编码的，目前估计线粒体蛋白质组总共包含 1136 个线粒体蛋白。

mtDNA是一个多拷贝基因组，在所有拷贝中都可以出现变异（同质性），或者在同一个细胞中可能存在多个mtDNA基因型（异质性）。由于细胞分裂过程中线粒体的随机分离，具有特定变异的 mtDNA 的比例可能会随着时间的推移在同一个体的组织之间或同一组织内发生变化，这一遗传过程由于在雌性生殖系胚胎发育期间发生的线粒体遗传瓶颈而变得复杂，并可导致在一代人内mtDNA变异水平的快速变化。当mtDNA突变的比例超过给定组织中的临界阈值（阈值效应）时，与异质致病变异相关的临床表现通常变得明显，而这个阈值因不同的mtDNA变异而异。

线粒体疾病可能是由核基因组或线粒体基因组的缺陷引起的，因此与所有可能的遗传模式有关：母系遗传、常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X连锁和新生的变异。原发性mtDNA致病变异包括单核苷酸变异（SNVs）和基因组重排，最常见的是单个大规模缺失。导致 mtDNA 耗竭的多重 mtDNA 缺失和 mtDNA 拷贝数减少都可能继发于原发性核基因缺陷。检测适当的组织以进行准确的基因诊断至关重要，因为一些致病变异随着年龄的增长在血液中逐渐下降（如MT-TL1 m.3243A>G （NC_012920.1））和其他可能局限于骨骼肌（如MT-TP m.15975T>C, m.16002T>C, m.15998A>T （NC_012920.1）和大规模mtDNA缺失）。

除了遗传咨询和获得生殖选择外，准确的基因检测和确定基因诊断对患者及其家属非常重要，可以提供有关预后和治疗的信息。有必要发布线粒体疾病基因检测指南，以帮助欧洲和国际线粒体诊断界实现一致的高质量服务。这些建议代表了由三个高度专业化的英国国家卫生服务（NHS）实验室整理的共识参考框架，这些实验室密切合作，为整个国家提供诊断检测。这种在三个中心之间分享经验和专门知识的独特合作方式促进了对诊断实践的全面审查和分析。对结果进行总结形成了最佳实践指南。本指南强调线粒体疾病实验室诊断的基本方面、诊断测试策略、线粒体DNA和核遗传变异的家庭测试和生殖选择，以及讨论检测方法、解释和报告。

由于临床和遗传的异质性以及有限的基因型-表型相关性，线粒体疾病的诊断具有挑战性。因此，有效的基因诊断往往需要多学科的方法。新一代测序技术（NGS）的出现推动了诊断实践的转变，从“活检优先”的方法（使用患者肌肉活检的一线生化和组织化学研究来指导后续分子分析）转向全基因组策略，可以使用血液DNA来加速许多病例的诊断，特别是那些与核基因缺陷相关的病例。与有针对性的常见致病性 mtDNA 变异测试相比，通过 NGS 对整个线粒体基因组进行系统分析提高了灵敏度，并有助于准确的异质性评估，但需要注意的是，更全面的检测也增加了检测不确定意义的变异的可能性。

遗传检测算法取决于转诊的原因、收到的样本类型和实验室服务安排。以下段落概述了先证者的诊断测试、已知家族致病遗传变异时的家庭测试以及在有线粒体疾病家族史的夫妇的生殖选择背景下进行的测试的策略。

对疑似线粒体疾病患者进行基因检测有两种主要替代方法/策略:（1）对 “常见”mtDNA 变异进行有针对性的检测和/或有针对性的核基因检测，然后在需要和资源允许的情况下进行更全面的检测；（2）线粒体基因组和/或核基因的NGS，如全外显子组测序（whole exome sequencing, WES）或全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）。

血液DNA的一线靶向检测适用于常规转诊（临床上没有迫切需要获得诊断的情况）、高度提示特定变异或基因的临床表现（例如，MELAS、MERRF、LHON、Pearson综合征、POLG 相关疾病）和/或资源有限的情况。对于血液中未检测到致病性变异的患者，可能会建议提供额外的临床信息和样本（例如尿液）或肌肉活检以进行生化和组织病理学研究。进一步的基因检测可以根据对剩余线粒体疾病的怀疑程度逐步进行。

此外，可以采用基于NGS的综合检测来进行敏感且高效的一线基因检测。这种方法可以适用于所有转诊适应症，但特别适合更复杂的表型和/或紧急转诊。由于mtDNA疾病和核线粒体疾病都占儿童期和成人期线粒体疾病的很大比例，如果可能，建议同时检测mtDNA和核DNA。然而，如果需要采取顺序性方法以降低成本，那么通常最适合先进行mtDNA检测，因为相较于大型核基因组测序（Panels式NGS，WES 或 WGS），全线粒体基因组NGS成本更低，周转时间也更短。对于紧急的儿科转诊，如果可以获得父母-子女三人的样本，那么无基因偏见的全外显子测序（WES）或全基因组测序（WGS）是一个适当的检测策略。这种方法在分析数据时，不使用基因面板或对与某种病症相关的变异位点有预设概念。尽管全基因组测序通常包括对整个线粒体基因组的深度测序（并进行适当的生物信息学分析），但无基因偏见的三人全外显子测序可能需要额外的全线粒体DNA的下一代测序，以可靠地以足够的敏感性筛查线粒体基因组。尽管有研究表明，来自全外显子测序的非目标读取可能就足够了（“基因测试方法和策略”部分有进一步讨论）。对于线粒体疾病是几种可能的鉴别诊断之一的转诊情况，无基因偏见的三人全基因组/全外显子测序也可能适用。

如图所示为疑似线粒体疾病患者转诊推荐的分子遗传检测算法流程（图1）。尽管全球各地的遗传检测途径可能会有一些差异，但在英国，我们提供的算法具有广泛适用性，并且与针对成年发病线粒体疾病的国际途径保持一致。

图1  线粒体疾病患者基因检测策略概述

上图：已采集血样。策略1是一种更有针对性的方法，可能适用于常规转诊或并行测试存在障碍的情况。策略2允许采用更迅速、更彻底但更昂贵的检测策略，并且适用于常规和临床紧急病例，如危重儿科患者。当采用策略2时，如果资源允许，建议同时检测mtDNA和核DNA；如果需要顺序检测，mtDNA检测可以优先进行，因为降低了成本和周转时间。

下图：接受肌肉活检。由于肌肉活检不再广泛应用于一线诊断，如果血液DNA的基因分析不能确定病因或不确定，该途径通常适用。

致病性 mtDNA 变异可以是影响蛋白质编码或线粒体 tRNA 变异的 SNV 或小插入/缺失突变，也可以是大规模 mtDNA 重排，例如“常见”的 4977 bp mtDNA 缺失，尽管这些变异的大小可能高度可变。

由于向“基因组学优先”的诊断方法过渡，mtDNA检测通常在诊断途径的早期通过血液和/或尿液DNA分析进行，如算法所示（图1）。然而，值得注意的是，肌肉仍然是检测一些mtDNA变异（如MT-TP m.15975T>C）和大规模mtDNA重排的首选样本类型；因此，如果血液/尿液分析不能确定基因诊断，可能需要肌肉活检。

随着 NGS 成本持续下降以及生物信息学流程变得越来越高效和复杂，mtDNA 测试越来越多地转向通过 mtDNA NGS、WES 或 WGS 进行一线全 mtDNA 测序。如上所述，WES 和 WGS 捕获可以同时分析核基因和mtDNA 基因。尽管如此，针对常见 mtDNA 变异和大规模 mtDNA 重排的针对性测试仍然是适当且具有成本效益的。表1提供了对最常见的诊断转诊原因适用的最低级别的有针对性mtDNA检测建议，以及可能需要更广泛检测的指导。

对于核线粒体疾病，核基因组可细分如下:

在对线粒体疾病进行遗传诊断后，建议先证者（及其家人）转诊至临床遗传学诊所或专业线粒体服务机构，以进行适当的遗传咨询和家庭随访。复发风险和其他家庭成员的风险取决于诊断是由核编码基因还是mtDNA 变异引起。

在核基因诊断为线粒体疾病的家庭中，咨询和进一步的家庭检测与特定基因的遗传方式有关（常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传或x连锁）。

在mtDNA相关诊断的家庭中，遗传可能是新生遗传或母系遗传，并且男性患者没有将mtDNA变异传递给后代的风险。

对16岁以下无症状且有mtDNA相关线粒体疾病家族史的无症状儿童进行检测尤其具有挑战性，英国的常规做法是不对这些儿童进行检测。5 岁以上的儿童可以进行超声心动图等临床检查，以确保没有心肌病的证据。可以提供持续的心脏监测，这应该在个案的基础上加以考虑。建议实验室在检测前尽可能与专科医生或临床遗传学家讨论无症状儿童基因检测的转诊。

下面详细介绍了 mtDNA 变异家族风险的其他考虑因素。

对于因核基因缺陷而已知有线粒体疾病家族史的夫妇，其生殖选择和遗传咨询与其他孟德尔病症类似。对于常染色体隐性遗传疾病，建议在提供产前诊断 (PND) 之前确认父母携带者状态。PND 可以通过绒毛膜绒毛取样（CVS，通常在妊娠 11-12 周）或通常在妊娠后期（妊娠 15-17 周）通过羊膜穿刺术提供。CVS或羊膜穿刺术的检测可以通过桑格测序或其他有针对性的方法对直接提取或培养的细胞进行。重要的是，还必须对所检测的胎儿 DNA 进行母体细胞污染 (MCC) 检测，以排除可能影响结果解释的严重污染。此类测试的指导方针已在其他地方提出。胚胎植入前遗传学诊断也可在专业实验室进行，通常遵循授权和批准这类检测的国家指南。

由于mtDNA严格的母系遗传，携带致病性mtDNA变异的男性患者可以放心，他们不会有将该变异遗传给后代的风险。由于卵子发生和疾病风险预测过程中mtDNA瓶颈的影响导致线粒体DNA变异传播的复杂性，女性患者的遗传咨询通常具有挑战性。可用的生殖选择也可能根据所涉及的致病变异种类和变异水平而有所不同。建议由临床遗传学诊所或专门的线粒体服务机构提供咨询，对所有可用的生殖选择进行评估。此外，建议尽可能在女性生育期早期开始此类咨询，因为随着年龄的增长和卵巢储备功能的下降，选择可能会变得有限。欧洲神经肌肉中心（ENMC）国际研讨会在制定线粒体疾病生殖选择管理指南方面发挥了重要作用，希望进一步探讨这一问题的人可能对此感兴趣。

在寻求产前诊断时，评估具有异质致病性mtDNA变异的妇女的疾病传播风险，应包括评估至少两种不同组织（如血液、尿液、口腔）的变异水平，并在可能的情况下检测其他母体亲属和任何受影响的后代。这种测试最好提前提供。

新生的致病性mtDNA突变已被报道；然而，然而，重要的是要考虑到该变异可能低于所测试的母体组织中的检测水平，并且不能排除母体生殖系嵌合体的可能性（即在母亲的生殖细胞中出现的基因突变，而这种突变并未出现在母亲的其他体细胞中）。

预防线粒体 DNA 疾病的产前检测是一种生殖选择，这对于一些有将mtDNA 致病性变异传播给后代的风险的女性来说是可行的。产前检测以预防线粒体DNA疾病是一种生殖选择，对一些有可能将线粒体DNA致病性变异遗传给后代的女性来说是可行的。对许多常见mtDNA变异的研究表明，大约在妊娠10周后，变异水平在发育中的胎儿中保持稳定；因此，产前样本可以估计所生孩子患线粒体疾病的风险。

至关重要的是，mtDNA 变异的产前检测应仅在直接 CVS/羊水细胞上进行，而不是在培养的细胞上进行，因为 mtDNA 变异的水平在培养过程中可能会发生变化。最近的出版物报道了在少数病例中，可能存在CVS 异质性和产后检测结果以及同一妊娠的胎盘样本之间存在高度差异；这些结果可以在提供 CVS 的背景下考虑，但是，根据我们的长期经验（未发表的研究结果），我们没有遇到 CVS 异质性水平和产前结果之间存在任何显著差异。

异质mtDNA变异：产前诊断可以为某些异质mtDNA变异体提供信息。预测突变水平的风险可能很困难，特别是在突变水平与疾病严重程度之间的相关性很复杂的情况下。对于MT-TL1 m.3243A>G致病变异，已经开发了一个模型，可以根据母体m.3243A>G 水平预测低于指定阈值的可能结果。对于具有独特分离模式的其他变体（如MT-ATP6 m.8993T>G p.（Leu156Arg）），对于大多数突变水平的可信预测是有可能的。在母体 DNA 中存在高水平变异的情况下，产前诊断通常是不合适的。然而，也有一些例外。当在高突变负载的女性的卵母细胞中观察到明显的突变水平偏态分布时，产前诊断可能是有用的。对于明显的新生mtDNA变异，如果需要保证，可以进行产前诊断。

此外，据报道，具有致病性 mtDNA 变异家族史且血液中检测不到突变水平的女性受孕发病的风险较低。对于这些女性来说，产前诊断仍然可以让她们放心，因为家族线粒体 DNA 变异可能低于血液中的检测水平，或者可能仅限于生殖系中。

同质mtDNA变异：对于任何同质型变异，通常都不适合进行产前诊断（请参阅“线粒体捐赠（线粒体替代疗法[MRT]）”部分）。对于与氨基糖苷类诱导的耳毒性和非综合征感觉神经性耳聋相关的MT-RNR1 m.1555A>G变异的产前诊断，被认为是不适当的，因为这种同质型变异并未与严重的神经表型相关联，而且可以在出生后进行检测。这可能作为一个护理点的检测，以便提供定制化的抗生素处方指导。

单一、大规模的mtDNA缺失：单次、大规模的mtDNA缺失通常是零星的，因此复发的风险很低。在一项研究中，对226个家庭进行了风险评估，其中在先证者中检测到了单一mtDNA缺失。临床上未发病的女性极不可能生育超过一个发病的孩子，而临床上发病的女性则有1/24的风险生育发病的孩子。如果需要，可以进行产前诊断以获得安心。

不同的分析方法可以满足上述一些或所有标准。这些包括：

有多种方法可供选择，包括:

MtDNA耗竭分析是一种定量测试，用于评估疑似 mtDNA 耗竭综合征 (MDS) 患者受临床影响的有丝分裂后组织（例如肌肉或肝脏）中的 mtDNA 拷贝数。由于核基因测试（确定mtDNA缺失综合征的主要遗传原因）的可用性增加，以及肌肉活检在诊断早期的频率降低，mtDNA拷贝数分析现在主要在从核基因测试中未获得确切诊断的情况下进行，即如果没有识别出遗传原因，或者如果检测到变异的未确定显性。

对于每种组织类型，必须使用来自正常对照样本的数据来确定正常mtDNA拷贝数变异的范围。此外，可能需要从正常对照中得到一个与年龄匹配的参考范围，因为有证据显示mtDNA拷贝数会随着年龄的变化而变化。目前，用于常规转诊的最常用方法涉及相对于核DNA的实时PCR定量。其他方法包括滴液数字PCR，Southern印迹法，NGS/WGS。

在肌肉或肝脏中检测到的mtDNA拷贝数减少的证据应与临床、组织学和呼吸链酶的发现一起解释，并且不能明确证实 mtDNA 耗竭综合征的诊断。特别是，这可能是由于采样问题和/或其他非线粒体疾病继发的线粒体 DNA 耗竭。

与Sanger测序相比，高通量测序更受青睐，因为它具有更大的可扩展性，更具成本效益，并且在检测下限（如果读取深度较高）和准确的异质性定量方面提供了更高的灵敏度。例如，在读数深度为500的情况下，根据二项分布计算，预计7.5%的杂合性变异将有99%的概率在≥5%的序列读数中被检测到。实验室必须遵循其他相关的最佳实践指南，其中包括Sanger测序和NGS方法。根据当地的验证和报告政策，NGS鉴定的可报告变异可能需要通过其他方法进行确认。随着测序技术的不断发展，未来有望利用新兴的NGS/第三代测序平台等替代方法进行全线粒体基因组测序。

除了靶向 NGS 方法外，还可利用 WES 或 WGS 对整个线粒体基因组进行测序。从 WES 或 WGS 获取诊断级数据（即足够的灵敏度和准确的异质性定量）取决于线粒体基因组的读取深度。WES的MtDNA序列数据来源于离靶读数，并且根据所使用的外显子组测序试剂盒而高度可变。因此，为了进行诊断性线粒体基因组测序，需要由测试实验室进行适当的验证。由于NUMTs可能导致假阳性变异调用的可能性，通常建议通过替代方法对mtDNA变异进行确认。这些方法可能包括Sanger测序或其他经过验证的技术，以确保结果的准确性。

核变异解释和致病性分类应遵循美国医学遗传学和基因组学学院和分子病理学协会 (ACMG/AMP)提出的最新指南，以及临床基因组资源 (ClinGen) 的相关规范。

临床基因组科学协会 (ACGS) 也制定了这些指南，提供澄清和代码强度修改，并定期进行审查。最新版本的指南可以在 ACGS 网站的质量部分找到[79]。建议实验室在其报告中说明他们使用哪些指南来解释和分类变异。

mtDNA 变异的致病性分类通常更具挑战性，ClinGen专家小组最近发布了 ACMG/AMP 标准规范和线粒体DNA解释指南。除了这些指南之外，下面还提出了一些简短的要点，以帮助实验室查询 mtDNA 变异的致病性：

mtDNA 和核 DNA 变异的功能评估对于提供支持或反对致病性的进一步证据非常有帮助。这些研究可能需要肌肉和/或其他组织活检，这可以由专业实验室进行。说明性的例子包括：研究具有组织化学缺陷的mtDNA 变异分离的单纤维研究；肌肉组织学和mtDNA缺失分析，以研究在与成人发病 mtDNA 维持障碍相关的基因中检测到的核变异的致病性；当在PDH缺乏相关基因中发现不确定意义的变异时，进行皮肤活检来测量 PDH 酶活性。

报告变异的分类非常重要，即致病性、可能致病性或不确定的意义。分类为良性或可能良性的变异通常不包含在患者报告中。报告意义不确定的变异可能不合适。这取决于当地实践以及进一步的调查/信息是否有助于解释；进一步的英国指导可从ACGS获得。

分子遗传学报告是患者、其家人和转诊临床医生的终生文件。因此，报告中提供的信息必须全面、清晰、简洁，并对所提出的临床问题提供全面的解释和明确的答案，这一点至关重要。除了概述关键限制并说明敏感性和特异性外，报告还应包含分析区域（例如，特定外显子、基因、基因面板）和所使用方法（例如，试剂盒参考和使用的版本（如果适用））的完整详细信息；或者，报告应包括一项声明，表明该信息可从实验室（或通过网站）获得。关于诊断分子遗传学报告的一般考虑的指南已发表，应予以遵守。

变体命名应遵循人类基因组变异学会（HGVS）所述的现行国际准则，而基因命名公约应遵循已批准的HUGO基因命名委员会。任何报告的编码变异都应在核苷酸水平和预测的蛋白质变化的水平上进行描述；这适用于核 DNA 变异和mtDNA 变异。还应提供所使用的参考序列。

在线粒体疾病（核或mtDNA相关）的任何诊断中，建议报告说明任何复发风险以及对其他家庭成员的影响，并建议转诊至临床遗传学诊所或专业线粒体服务机构进行遗传咨询和适当的家庭随访。如果尚未得出诊断（未检测到变异或临床意义不确定且可能需要进一步调查的变异），报告应包含一条评论，要求提供额外的临床信息或其他样本以进行进一步适当的测试（例如肌肉活检）；根据所进行的测试的程度，还可能适当地评论进行进一步测试/分析的可能性（例如，对临床重叠的非线粒体疾病的基因组进行分析，或与基因无关的分析）。在报告与癌症易感性相关的单等位基因显性SDHx变异（嗜铬细胞瘤和副神经节瘤）时，还应特别考虑；这种风险应包含在报告中，并建议转诊至临床遗传学诊所。

下面给出了报告 mtDNA 变异的更具体考虑因素：

建议实验室按照分子遗传检测质量保证指南遵循已建立的良好实验室规范。此外，实验室应力求通过获得正式认可，证明符合国际公认的标准（如ISO标准15189:2012医学实验室）。鼓励每年参加适当的外部质量评估（EQA）计划，因为它提供独立的熟练程度证据，促进持续的质量保证和能力，并促进教育。此外，在无法参加正式 EQA 计划的地方，可以安排实验室间的样品交换。

由于线粒体和核基因组的双重参与，线粒体疾病包含广泛的临床表型，这通常使临床和分子诊断变得复杂且具有挑战性。mtDNA变体在遗传、异质性和阈值效应方面的独特特征进一步混淆了这一点。这里提出的建议已经通过英国临床基因组科学协会的批准，经过全英实验室的协商，并对同一组的先前指导进行了更新，包括线粒体基因组检测的最近进展。这篇文章的目的是将这些建议呈现给国际科学读者，并强调线粒体疾病的分子诊断的当前基因策略，包括检测、解释和为患者及其家庭报告的各个方面。